Den größten Schatz der Bibliothek stellen die 316 Handschriften vom 8./9.–18. Jahrhundert dar, von denen noch ca. 270 aus dem Nachlass von Nikolaus von Kues stammen. Die Handschriften, von denen viele noch persönliche Randbemerkungen enthalten, spiegeln das Interessensspektrum des Universalgelehrten wider. Thematisch reichen sie von den Schriften der Bibel, der Kirchenväter und der Scholastik, über liturgische, mystische, geographische, historische und philosophische Werke bis hin zu Astronomie, Medizin und Recht.  

Zu den bedeutendsten Büchern der Sammlung gehören die beiden Pergamenthandschriften Cod. Cus. 218 und 219 mit den wichtigsten Werken des Nikolaus von Kues, Cod. Cus. 220, mit den von ihm persönlich aufgeschriebenen Predigten, sowie Cod. Cus. 221, eine der Hauptquellen zur Auseinandersetzung zwischen Nikolaus von Kues und Herzog Sigismund von Tirol. Als ebenso wertvoll gelten die persönliche Bibel des Nikolaus von Kues (Cod. Cus. 4) sowie zwei griechisch-lateinische Psalter aus dem 8./9. Jahrhundert (Cod. Cus. 9 und 10). 

Einen besonderen Stellenwert nahmen für Cusanus vor allem die Handschriften der antiken Philosophie und Patristik mit den Werken Platons (Cod. 177f., 185f.) und Aristoteles ‚(u.a. Cod. Cus. 179–184, 187–189) sowie zahlreicher neuplatonischer Autoren wie Proklos (Cod. Cus, 185, 186 oder 195) oder Ps.-Dionysios Areopagita (Cod. Cus. 43–45) ein. In seinem Besitz befanden sich aber auch die Schriften vieler mittelalterlicher und zeitgenössischer Gelehrter wie Meister Eckhart (Cod. Cus. 21), Ramon Llull (u. a. Cod. Cus. 81–88) oder Enea Silvio Piccolomini (Cod. Cus. 39). 

Neben einfachen Gebrauchshandschriften enthält die Sammlung aber auch einige bibliophile Kostbarkeiten, wie z. B. ein ‚Pontificale Romanum‘ (Cod. Cus. 131), eine liturgische Handschrift, die Cusanus anlässlich seiner Weihe zum Bischof von Brixen von Papst Nikolaus V. geschenkt wurde, sowie die ‚Nikomachischen Ethik‘ des Aristoteles (Cod. Cus. 179) mit dem Krebs-Wappen des Kardinals.

Auch nach dem Tod des Cusanus wurde die Handschriftensammlung erweitert und ausgebaut. Zu den spektakulärsten Zugängen gehören z. B. die ‚Springiersbacher Riesenbibel‘ aus dem 12. Jahrhundert (Cod. Cus. 8) und eine frühe Abschrift der ‚Scivias‘ Hildegards von Bingen von 1210 (Cod. Cus. 63) aus dem Benediktinerkloster St. Matthias in Trier, die noch im 19. Jahrhundert ihren Weg in die Bibliothek fanden, sowie seit 2014 ein Sammelband mit der deutschen Vater-unser-Auslegung (Sermo XXIV) des Nikolaus von Kues (Cod. Cus. 220a) aus dem 15. Jahrhundert.

Kataloge und Hilfsmittel:

• Einzelne Kopien und Mikrofilme der Handschriftensammlung des Hospitals werden im Cusanus-Institut in Trier und in der  Hill Museum & Manuscript Library in Collegeville, MN aufbewahrt. 
• Kraus, Franz Xaver: Die Handschriften-Sammlung des Cardinals Nicolaus von Cusa. In: Serapeum 25 (1864), S. 353–365, 369–383; Serapeum 26 (1865), 24–31, 33–42, 49–59, 65–76, 81–89, 97–104 (auch als Sonderdruck in 12 Exemplaren veröffentlicht).
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• Marx, Jacob: Verzeichnis der Handschriften-Sammlung des Hospitals zu Cues bei Bernkastel a./Mosel, Trier 1905 (Digitalisat). Download